Les test PCR sont inadaptés pour identifier le virus SRAS-CoV-2! Dix failles scientifiques majeures au niveau moléculaire et méthologique passées au crible de 21 scientifiques de renom!
RAPPORT D'EXAMEN CORMAN-DROSTEN
RÉDIGÉ PAR UN CONSORTIUM INTERNATIONAL DE SCIENTIFIQUES EN SCIENCES DE LA VIE (ICSLS)
Rapport de synthèse Corman-Drosten et al. Eurosurveillance 2020
27 novembre 2020
Rapport officiel en version originale ici
Ce rapport de synthèse a été officiellement soumis au comité éditorial d'Eurosurveillance le 27 novembre 2020 via leur portail de soumission. Une lettre de demande de rétractation (traduite ici), signée par tous les auteurs et co-auteurs principaux, est jointe à ce rapport de synthèse. Le premier et le dernier nom listés sont le premier et le second auteur principal. Tous les autres noms sont des co-auteurs.
L'examen externe par les pairs du test RTPCR de détection du SRAS-CoV-2 révèle 10 failles scientifiques majeures au niveau moléculaire et méthodologique : conséquences sur les résultats faussement positifs.
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Pieter Borger(1), Bobby Rajesh Malhotra(2), Michael Yeadon(3), Clare Craig(4), Kevin McKernan(5), Klaus Steger(6), Paul McSheehy(7), Lidiya Angelova(8), Fabio Franchi(9), Thomas Binder(10) , Henrik Ullrich(11) , Makoto Ohashi(12) , Stefano Scoglio(13) , Marjolein Doesburg-van Kleffens(14) , Dorothea Gilbert(15) , Rainer Klement(16) , Ruth Schruefer(17) , Berber W. Pieksma(18), Jan Bonte(19), Bruno H. Dalle Carbonare(20), Kevin P. Corbett(21), Ulrike Kämmerer(22)
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RÉSUMÉ
Dans la publication intitulée "Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR" (Eurosurveillance 25(8) 2020), les auteurs présentent un flux de travail diagnostique et un protocole RT-qPCR pour la détection et le diagnostic du 2019-nCoV (désormais connu sous le nom de SARS-CoV-2), qu'ils prétendent être validés et constituer une méthodologie diagnostique robuste pour une utilisation dans les laboratoires de santé publique.
À la lumière de toutes les conséquences de cette publication pour les sociétés du monde entier, un groupe de chercheurs indépendants a procédé à un examen point par point de la publication susmentionnée, dans lequel 1) tous les composants de la conception du test présenté ont été vérifiés, 2) les recommandations du protocole RT-qPCR ont été évaluées par rapport aux bonnes pratiques de laboratoire et 3) les paramètres ont été examinés par rapport à la littérature scientifique pertinente couvrant le domaine.
Le protocole RT-qPCR publié pour la détection et le diagnostic du 2019-nCoV et le manuscrit présentent de nombreuses erreurs techniques et scientifiques, notamment une conception insuffisante des amorces, un protocole RT-qPCR problématique et insuffisant, et l'absence d'une validation précise du test. Ni le test présenté ni le manuscrit lui-même ne remplissent les conditions d'une publication scientifique acceptable. En outre, les graves conflits d'intérêts des auteurs ne sont pas mentionnés. Enfin, le délai très court entre la soumission et l'acceptation de la publication (24 heures) signifie qu'un processus systématique de révision par les pairs n'a pas été effectué ici, ou qu'il était de mauvaise qualité. Nous fournissons des preuves irréfutables de plusieurs insuffisances, erreurs et failles scientifiques.
Compte tenu des défauts scientifiques et méthodologiques présentés ici, nous sommes convaincus que le comité éditorial d'Eurosurveillance n'a d'autre choix que de rétracter la publication.
RAPPORT D'EXAMEN CONCIS
Cet article montre de nombreuses failles graves dans l'article de Corman-Drosten, dont l'importance a conduit à un mauvais diagnostic mondial des infections attribuées au SRAS-CoV-2 et associées à la maladie COVID-19. Nous sommes confrontés à des fermetures rigoureuses qui ont détruit la vie et les moyens de subsistance de nombreuses personnes, à un accès limité à l'éducation et ces restrictions imposées par les gouvernements du monde entier constituent une attaque directe contre les droits fondamentaux des personnes et leurs libertés individuelles, entraînant des dommages collatéraux pour des économies entières à l'échelle mondiale.
Le document de Corman-Drosten présente dix problèmes majeurs que nous allons exposer et expliquer plus en détail dans les sections suivantes.
Le premier et principal problème est que le nouveau coronavirus SARS-CoV-2 (nommé 2019-nCoV dans la publication et SARS-CoV-2 en février 2020 par un consortium international d'experts en virus) est basé sur des séquences in silico (théoriques), fournies par un laboratoire en Chine [1], car à l'époque, les auteurs ne disposaient ni de matériel de contrôle de SARS-CoV-2 infectieux ("vivant") ou inactivé, ni d'ARN génomique isolé du virus. À ce jour, aucune validation n'a été effectuée par les auteurs sur la base de virus SARS-CoV-2 isolés ou de leur ARN complet. Selon Corman et al :
"Notre objectif était de développer et de déployer une méthodologie de diagnostic robuste pouvant être utilisée dans les laboratoires de santé publique sans disposer de matériel viral." [1]
L'accent doit être mis ici sur les deux objectifs déclarés : a) le développement et b) le déploiement d'un test de diagnostic à utiliser dans les laboratoires de santé publique. Ces objectifs ne peuvent être atteints sans disposer de matériel viral réel (par exemple, pour déterminer la charge virale infectieuse). En tout état de cause, seul un protocole d'une précision maximale peut être l'objectif obligatoire et principal dans tout scénario-résultat de cette ampleur. La détermination de la charge virale critique est une information obligatoire, et il est de la responsabilité du groupe de Christian Drosten de réaliser ces expériences et de fournir les données cruciales.
Néanmoins, ces séquences in silico ont été utilisées pour développer une méthodologie de test RT-PCR pour identifier le virus susmentionné. Ce modèle était basé sur l'hypothèse que le nouveau virus est très similaire au SARS-CoV de 2003, les deux étant des bêta-coronavirus.
Le test PCR a donc été conçu en utilisant la séquence génomique du SARS-CoV comme matériau de contrôle pour le composant Sarbeco ; nous le savons grâce à notre communication personnelle par courriel avec [2] l'un des co-auteurs de l'article de Corman-Drosten. Cette méthode de modélisation du SARS-CoV-2 était décrite dans l'article de Corman-Drosten comme suit :
"l'établissement et la validation d'un flux de travail diagnostique pour le dépistage et la confirmation spécifique du 2019-nCoV, conçu en l'absence d'isolats de virus disponibles ou de spécimens originaux de patients. La conception et la validation ont été rendues possibles par l'étroite parenté génétique avec le CoV du SRAS de 2003, et facilitées par l'utilisation de la technologie des acides nucléiques synthétiques."
La réaction en chaîne de la polymérase par transcription inverse (RT-PCR) est une importante technologie biomoléculaire permettant de détecter rapidement des fragments d'ARN rares, connus à l'avance. Dans la première étape, les molécules d'ARN présentes dans l'échantillon sont transcrites de manière inverse pour produire de l'ADNc. L'ADNc est ensuite amplifié dans la réaction en chaîne par polymérase à l'aide d'une paire d'amorces spécifiques et d'une enzyme ADN polymérase thermostable. Cette technologie est très sensible et sa limite de détection est théoriquement de 1 molécule d'ADNc. La spécificité de la PCR est fortement influencée par les erreurs de conception biomoléculaire.
Qu'est-ce qui est important lors de la conception d'un test RT-PCR et du test quantitatif RT-qPCR décrit dans la publication de Corman-Drosten ?
1. Les amorces et les sondes :
a) la concentration des amorces et des sondes doit être dans une gamme optimale
(100-200 nM)
b) doivent être spécifiques au gène cible que vous voulez amplifier
c) doivent avoir un pourcentage optimal de teneur en GC par rapport aux bases azotées totales (minimum 40 %, maximum 60 %)
d) pour le diagnostic des virus, au moins 3 paires d'amorces doivent détecter 3 gènes viraux (de préférence aussi éloignés que possible dans le génome viral).
2. La température à laquelle toutes les réactions ont lieu :
a) température de fusion de l'ADN (>92°)
b) température d'amplification de l'ADN (TaqPol spécifique)
c) Tm ; la température d'hybridation (la température à laquelle les amorces et les sondes atteignent la liaison/détachement de la cible, qui ne doit pas dépasser 2 ̊C par paire d'amorces). Tm dépend fortement de la teneur en GC des amorces.
3. Le nombre de cycles d'amplification (moins de 35 ; de préférence 25-30 cycles) ;
Dans le cas de la détection de virus, >35 cycles ne détecte que des signaux qui ne sont pas en corrélation avec un virus infectieux tel que déterminé par l'isolement en culture cellulaire [examiné dans 2] ; si une personne est testée par PCR comme étant positive lorsqu'un seuil de 35 cycles ou plus est utilisé (comme c'est le cas dans la plupart des laboratoires en Europe et aux États-Unis), la probabilité que ladite personne soit réellement infectée est inférieure à 3%, la probabilité que ledit résultat soit un faux positif est de 97% [examiné dans 3].
4. Validations biologiques moléculaires : les produits PCR amplifiés doivent être validés soit en faisant passer les produits dans un gel avec une règle à ADN, soit par séquençage direct de l'ADN.
5. Des contrôles positifs et négatifs doivent être spécifiés pour confirmer ou infirmer la détection spécifique du virus.
6. Une procédure opérationnelle standard (SOP) doit être disponible.
La SOP spécifie sans équivoque les paramètres ci-dessus, de sorte que tous les laboratoires soient en mesure de mettre en place exactement les mêmes conditions de test. Il est essentiel de disposer d'une SOP universelle validée, car elle permet de comparer les données dans et entre les pays.
PRÉOCCUPATIONS MINEURES CONCERNANT L'ARTICLE DE CORMAN-DROSTEN
1. Dans le tableau 1 de l'article de Corman-Drosten, différentes abréviations sont indiquées - "nM" est spécifié, "nm" ne l'est pas. De plus, en ce qui concerne la nomenclature correcte, nm signifie "nanomètre", donc nm devrait se lire nM ici.
2. Le consensus général est d'écrire les séquences génétiques toujours dans le sens 5'-3', y compris les amorces inverses. Il est très inhabituel de faire un alignement avec une écriture complémentaire inverse de la séquence d'amorce comme l'ont fait les auteurs dans la figure 2 de l'article de Corman-Drosten. Ici, en plus, une base wobble est marquée comme "y" sans description des bases que le Y représente.
3. Deux pièges trompeurs dans l'article de Corman-Drosten sont que leur tableau 1 n'inclut pas les valeurs Tm (valeurs de température de recuit), ni les valeurs GC (nombre de G et de C dans les séquences en tant que valeur en % du total des bases).
PRINCIPALES PRÉOCCUPATIONS CONCERNANT L'ARTICLE DE CORMAN-DROSTEN
A) CONTEXTE
Les auteurs présentent le contexte de leur travail scientifique comme suit : "L'épidémie en cours du nouveau coronavirus récemment apparu (2019-nCoV) représente un défi pour les laboratoires de santé publique car les isolats du virus ne sont pas disponibles, alors qu'il y a de plus en plus de preuves que l'épidémie est plus répandue qu'on ne le pensait initialement, et que la propagation internationale par les voyageurs existe déjà".
Selon BBC News [4] et Google Statistics [5], il y a eu 6 décès dans le monde le 21 janvier 2020 - le jour où le manuscrit a été soumis. Pourquoi les auteurs ont-ils supposé un défi pour les laboratoires de santé publique alors qu'il n'y avait aucune preuve substantielle à ce moment-là pour indiquer que l'épidémie était plus répandue qu'on ne le pensait initialement ?
Les auteurs ont déclaré avoir pour objectif de mettre au point et de déployer une méthodologie de diagnostic robuste à utiliser dans les laboratoires de santé publique sans disposer de matériel viral. En outre, ils reconnaissent que "la présente étude démontre l'énorme capacité de réponse obtenue grâce à la coordination des laboratoires universitaires et publics dans les réseaux de recherche nationaux et européens."
B) MÉTHODES ET RÉSULTATS
1. Conception des amorces et des sondes
1a) Concentrations erronées des amorces
Les protocoles de test PCR fiables et précis sont normalement conçus en utilisant entre 100 nM et 200 nM par amorce [7]. Dans l'article de Corman-Drosten, nous observons des concentrations d'amorces anormalement élevées et variables pour plusieurs amorces (tableau 1). Pour les paires d'amorces RdRp_SARSr-F et RdRp_SARSr-R, 600 nM et 800 nM sont décrits, respectivement. De même, pour l'ensemble des amorces N_Sarbeco_F et N_Sarbeco_R, elles conseillent 600 nM et 800 nM, respectivement [1].
Il devrait être clair que ces concentrations sont beaucoup trop élevées pour être optimales pour les amplifications spécifiques des gènes cibles. Il n'existe aucune raison particulière d'utiliser ces concentrations extrêmement élevées d'amorces dans ce protocole. Au contraire, ces concentrations conduisent à une augmentation de la liaison non spécifique et de l'amplification du produit PCR.
Tableau 1 : Amorces et sondes (adapté de l'article de Corman-Drosten ; les concentrations erronées des amorces sont mises en évidence)
Pour obtenir des résultats reproductibles et comparables, il est essentiel de définir distinctement les paires d'amorces. Dans l'article de Corman-Drosten, nous avons observé six positions non spécifiées, indiquées par les lettres R, W, M et S (tableau 2). La lettre W signifie qu'à cette position, il peut y avoir soit un A soit un T ; R signifie qu'il peut y avoir soit un G soit un A ; M indique que la position peut être soit un A soit un C ; la lettre S indique qu'il peut y avoir soit un G soit un C sur cette position.
Ce nombre élevé de variantes est non seulement inhabituel, mais il est également très déroutant pour les laboratoires. Ces six positions non spécifiées pourraient facilement donner lieu à la conception de plusieurs séquences d'amorces alternatives différentes qui ne sont pas liées au SRAS-CoV-2 (2 amorces RdRp_SARSr_F distinctes + 8 sondes RdRp_SARS_P1 distinctes + 4 RdRp_SARSr_R distinctes). Les variations de conception conduiront inévitablement à des résultats qui ne sont même pas liés au SRAS CoV-2. Par conséquent, la description confuse et non spécifique de l'article de Corman-Drosten ne peut servir de protocole opérationnel standard. Ces positions non spécifiées auraient dû être conçues sans équivoque.
Ces séquences bancales ont déjà suscité des inquiétudes dans le domaine et ont donné lieu à une lettre à l'éditeur rédigée par Pillonel et al [8] concernant des erreurs flagrantes dans les séquences décrites. Ces erreurs sont également évidentes dans le supplément de Corman et al.
Tableau 2 : Amorces et sondes (adapté de l'article de Corman-Drosten ; les nucléotides non spécifiés (" Wobbly ") dans les amorces sont mis en évidence).
L'article de Corman-Drosten identifie en outre un troisième gène qui, selon le protocole de l'OMS, n'a pas été validé davantage et a été jugé inutile :
"Il convient de noter que le test du gène N a également donné de bons résultats mais n'a pas été soumis à une validation supplémentaire intensive car il était légèrement moins sensible."
Il s'agit d'une omission regrettable, car il serait préférable d'utiliser les trois PCR génétiques comme tests de confirmation, ce qui aurait permis d'obtenir un protocole d'outil de diagnostic de détection de l'ARN viral presque suffisant. Trois étapes de test de confirmation auraient au moins permis de minimiser les erreurs et les incertitudes à chaque étape en ce qui concerne les taches "bancales". (Néanmoins, le protocole serait toujours en deçà de toute "bonne pratique de laboratoire", si l'on tient compte de toutes les autres erreurs de conception).
En l'état actuel des choses, le test du gène N n'est malheureusement pas proposé dans la recommandation de l'OMS (figure 1) comme une troisième étape de confirmation obligatoire et cruciale, et il n'est pas non plus souligné dans l'article de Corman-Drosten comme une assurance facultative importante "pour un travail de routine" (tableau 2).
Figure 1 : Le test de confirmation du gène N n'est pas souligné comme une troisième étape nécessaire dans la recommandation officielle du protocole Drosten-Corman de l'OMS ci-dessous [8] et n'est pas non plus requis comme une étape cruciale pour une plus grande précision des tests dans la publication d'Eurosurveillance.
1c) Contenu GC erroné (discuté en 2c, ainsi que la température de recuit (Tm))
1d) Détection de gènes viraux
La RT-PCR n'est pas recommandée pour le diagnostic primaire de l'infection. C'est pourquoi le test RT-PCR utilisé en routine clinique pour la détection du COVID-19 n'est pas indiqué pour le diagnostic du COVID-19 sur une base réglementaire.
"Les cliniciens doivent reconnaître la précision et la rapidité accrues des techniques de diagnostic moléculaire pour le diagnostic des infections, mais aussi comprendre leurs limites. Les résultats de laboratoire doivent toujours être interprétés dans le contexte de la présentation clinique du patient, et un site approprié, la qualité et le moment de la collecte des échantillons sont nécessaires pour obtenir des résultats de test fiables". [9]
Bien que l'article de Corman-Drosten décrive 3 amorces, ces amorces ne couvrent qu'environ la moitié du génome du virus. Il s'agit d'un autre facteur qui diminue la spécificité de la détection de l'ARN intact du virus COVID-19 et qui augmente la proportion de résultats faussement positifs.
Par conséquent, même si nous obtenons trois signaux positifs (c'est-à-dire que les trois paires d'amorces donnent 3 produits d'amplification différents) dans un échantillon, cela ne prouve pas la présence d'un virus. Une meilleure conception des amorces consisterait à avoir des amorces terminales aux deux extrémités du génome viral. En effet, l'ensemble du génome viral serait couvert et trois signaux positifs permettraient de mieux distinguer un virus complet (et donc potentiellement infectieux) de génomes viraux fragmentés (sans pouvoir infectieux). Pour pouvoir déduire quoi que ce soit d'important sur l'infectivité du virus, le gène Orf1, qui code l'enzyme réplicase essentielle des virus SARS-CoV, aurait dû être inclus comme cible (figure 2). Le positionnement des cibles dans la région du génome viral qui est la plus fortement et la plus variablement transcrite est une autre faiblesse du protocole.
Kim et al. démontrent une expression très variable en 3' de l'ARN subgénomique dans le Sars-CoV-2 [23]. Ces ARN sont activement surveillés comme signatures pour les patients asymptomatiques et non infectieux [10]. Il est très discutable de dépister une population de personnes asymptomatiques avec des amorces de qPCR qui ont 6 paires de base de dimère d'amorce à l'extrémité 3 de l'amorce (Figure 3).
Apparemment, l'OMS recommande ces amorces. Nous avons testé tous les dérivés de wobble de l'article de Corman-Drosten avec l'outil web de Thermofisher sur les dimères d'amorces [11]. L'amorce RdRp forward présente une homologie de 6bp 3prime avec Sarbeco E Reverse. À des concentrations d'amorce élevées, cela suffit à créer des inexactitudes.
Il s'agit de graves erreurs de conception, puisque le test ne peut pas faire la distinction entre le virus entier et les fragments viraux. Le test ne peut pas être utilisé pour le diagnostic des virus du SRAS.
Figure 2 : positions relatives des cibles des amplicons sur le coronavirus du SRAS et sur le génome du nouveau coronavirus de 2019. ORF : cadre de lecture ouvert ; RdRp : ARN polymérase ARN-dépendante. Les numéros sous l'amplicon sont les positions du génome selon SARS-CoV, NC_004718 [1] ;
Figure 3 : Un test avec l'outil web de dimère d'amorce de Thermofischer révèle que l'amorce avant RdRp a une homologie 3`prime de 6bp avec Sarbeco E Reverse (case de gauche). Un autre test révèle qu'il existe une correspondance parfaite pour l'une des amorces N avec un pathogène clinique (Pantoea) trouvé chez les patients immunodéprimés (case de droite).
2. Températures de réaction
2a) Température de fusion de l'ADN (>92°).
Traité de manière adéquate dans l'article de Corman-Drosten.
2b) Température d'amplification de l'ADN.
Cette question est traitée de manière adéquate dans l'article de Corman-Drosten.
La température d'annexion détermine à quelle température l'amorce s'attache/se détache de la séquence cible. Pour une amplification efficace et spécifique, la teneur en GC des amorces doit respecter un minimum de 40% et un maximum de 60% d'amplification. Comme l'indique le tableau 3, trois des amorces décrites dans l'article de Corman-Drosten ne se situent pas dans la fourchette normale de teneur en GC. Deux amorces (RdRp_SARSr_F et RdRp_SARSr_R) ont des valeurs GC inhabituelles et très basses de 28%-31% pour toutes les variantes possibles de bases wobbles, tandis que l'amorce E_Sarbeco_F a une valeur GC de 34,6% (tableau 3 et deuxième panneau du tableau 3).
La température de recuit (Tm) est un facteur crucial pour la détermination de la spécificité/précision de la procédure de qPCR et est essentielle pour évaluer la précision des protocoles de qPCR. Recommandation de bonne pratique : Les deux amorces (avant et arrière) doivent avoir une valeur presque similaire, de préférence identique.
Nous avons utilisé le logiciel gratuit de conception d'amorces Primer-BLAST [12, 25] pour évaluer les valeurs des meilleures pratiques pour toutes les amorces utilisées dans l'article de Corman-Drosten (Tableau 3). Nous avons essayé de trouver une valeur de Tm de 60° C, tout en recherchant de la même manière la valeur de GC% la plus élevée possible pour toutes les amorces. Une différence maximale de Tm de 2° C au sein des paires d'amorces a été considérée comme acceptable. En testant les paires d'amorces spécifiées dans l'article de Corman-Drosten, nous avons observé une différence de 10° C par rapport à la température de recuit Tm pour la paire d'amorces 1 (RdRp_SARSr_F et RdRp_SARSr_R). Il s'agit d'une erreur très grave qui rend le protocole inutile en tant qu'outil de diagnostic spécifique.
Des tests supplémentaires ont démontré que seule la paire d'amorces conçue pour amplifier le gène N (N_Sarbeco_F et N_Sarbeco_R) a atteint le standard adéquat pour fonctionner dans un test de diagnostic, puisqu'elle a un contenu GC suffisant et que la différence de Tm entre les amorces (N_Sarbeco_F et N_Sarbeco_R) est de 1,85° C (en dessous du maximum crucial de 2° C de différence). Il est important de noter qu'il s'agit du gène qui n'a été ni testé dans les échantillons de virus (tableau 2) ni mis en évidence comme test de confirmation. En plus des températures de fusion très variables et des séquences dégénérées dans ces amorces, un autre facteur a un impact sur la spécificité de la procédure : les dNTP (0,4uM) sont 2x plus élevés que ce qui est recommandé pour une amplification hautement spécifique. Du sulfate de magnésium est également ajouté à la réaction. Cette procédure, combinée à une température de recuit basse, peut créer des amplifications non spécifiques. Lorsque du magnésium supplémentaire est nécessaire pour la qPCR, la spécificité du test doit être examinée de plus près.
Il convient de noter que l'article de Corman-Drosten ne mentionne nulle part qu'un test est positif ou négatif, ni même ce qui définit un résultat positif ou négatif. Ces types de tests de diagnostic virologique doivent être basés sur une procédure opératoire standardisée, comprenant un nombre validé et fixe de cycles PCR (valeur Ct) après lequel un échantillon est considéré comme positif ou négatif. La valeur Ct maximale raisonnablement fiable est de 30 cycles. Au-delà d'un Ct de 35 cycles, il faut s'attendre à un nombre rapidement croissant de faux positifs.
Les données PCR évaluées comme positives après une valeur Ct de 35 cycles ne sont absolument pas fiables.
Citant Jaafar et al. 2020 [3] : " À Ct = 35, la valeur que nous avons utilisée pour signaler un résultat positif pour la PCR, <3% des cultures sont positives. " En d'autres termes, il n'y a pas eu d'isolement réussi du virus du SRAS-CoV-2 à ces valeurs élevées de Ct.
En outre, des études scientifiques montrent que seuls les virus non infectieux (morts) sont détectés avec des valeurs de Ct de 35 [22].
Entre 30 et 35, il existe une zone grise, où un test positif ne peut être établi avec certitude. Cette zone doit être exclue. Bien sûr, on pourrait effectuer 45 cycles de PCR, comme le recommande le protocole Corman-Drosten de l'OMS (figure 4), mais il faudrait alors définir une valeur de Ct raisonnable (qui ne devrait pas dépasser 30). Mais un résultat d'analyse avec une valeur Ct de 45 n'a absolument aucune signification scientifique et diagnostique (une valeur Ct raisonnable ne doit pas dépasser 30). Tout cela doit être communiqué très clairement. Le fait que l'article de Corman-Drosten ne mentionne pas la valeur Ct maximale à partir de laquelle un échantillon peut être considéré sans ambiguïté comme un résultat d'analyse positif ou négatif est une erreur importante. Cette importante limite de seuil de cycle n'est pas non plus spécifiée dans les soumissions de suivi à ce jour.
Figure 4 : Recommandation relative au kit RT-PCR dans le protocole officiel Corman-Drosten de l'OMS [8]. Seule une valeur "Cycler" (cycles) est trouvée sans Ct (valeur seuil) correspondant et scientifiquement raisonnable. Cette valeur ou toute autre valeur de cycle ne figure nulle part dans le document de Corman-Drosten.
Pour déterminer si les produits amplifiés sont bien des gènes du SRAS-CoV-2, la validation biomoléculaire des produits PCR amplifiés est essentielle. Pour un test de diagnostic, cette validation est une nécessité absolue.
La validation des produits PCR doit être effectuée en faisant passer le produit PCR dans un gel d'agarose-EtBr à 1% avec un indicateur de taille (règle ou échelle d'ADN) afin de pouvoir estimer la taille du produit. Cette taille doit correspondre à la taille calculée du produit d'amplification. Mais il est encore mieux de séquencer le produit d'amplification. Ce dernier donnera une certitude à 100% sur l'identité du produit d'amplification. Sans validation moléculaire, on ne peut pas être sûr de l'identité des produits PCR amplifiés. Compte tenu des graves erreurs de conception décrites précédemment, les produits PCR amplifiés peuvent être n'importe quoi.
L'article de Corman-Drosten ne mentionne pas non plus le cas des petits fragments de qPCR (environ 100bp) : Il peut s'agir d'un gel d'agarose à 1,5% ou même d'un gel d'acrylamide.
Le fait que ces produits PCR n'aient pas été validés au niveau moléculaire est une autre erreur frappante du protocole, rendant tout test basé sur celui-ci inutile comme outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus SARS-CoV-2.
5. Contrôles positifs et négatifs pour confirmer/réfuter la détection spécifique du virus.
L'hypothèse non confirmée décrite dans l'article de Corman-Drosten est que le SRAS-CoV-2 est le seul virus du groupe des bêta-coronavirus apparentés au SRAS qui cause actuellement des infections chez l'homme. Les séquences sur lesquelles repose leur méthode PCR sont des séquences in silico, fournies par un laboratoire en Chine [23], car au moment de la mise au point du test PCR, les auteurs ne disposaient d'aucun matériel de contrôle du SRAS-CoV-2 infectieux ("vivant") ou inactivé. Le test PCR a donc été conçu en utilisant la séquence du SARS-CoV connu comme matériel de contrôle pour le composant Sarbeco (Dr Meijer, co-auteur du document Corman-Drosten dans un échange de courriels avec le Dr Peter Borger) [2].
Toutes les personnes qui obtiennent un résultat positif au test RT-PCR, tel que décrit dans l'article de Corman-Drosten, sont supposées être infectées par le CoV-2 du SRAS. Cette hypothèse comporte trois graves lacunes. Premièrement, un test positif pour les molécules d'ARN décrites dans l'article de Corman-Drosten ne peut être assimilé à une "infection par un virus". Un test RT-PCR positif indique simplement la présence de molécules d'ARN viral. Comme démontré au point 1d (ci-dessus), le test de Corman-Drosten n'a pas été conçu pour détecter le virus complet, mais seulement un fragment du virus. Nous avons déjà conclu que cela classait le test comme inadapté en tant que test de diagnostic
pour les infections par le virus du SRAS.
Deuxièmement, et c'est très important, la fonctionnalité du test RT-PCR publié n'a pas été démontrée par l'utilisation d'un contrôle positif (ARN isolé du SRAS-CoV-2), qui est un étalon-or scientifique essentiel.
Troisièmement, l'article de Corman-Drosten déclare :
"Pour montrer que les tests peuvent détecter d'autres virus liés au SRAS associés aux chauves-souris, nous avons utilisé le test du gène E pour tester six échantillons fécaux dérivés de chauves-souris disponibles auprès de Drexler et al. [...] et Muth et al. [...]. Ces échantillons positifs au virus provenaient de chauves-souris rhinolophes européennes. La détection de ces valeurs phylogénétiques aberrantes au sein du clade CoV lié au SRAS suggère que tous les virus asiatiques sont susceptibles d'être détectés. Cela permettrait, en théorie, d'assurer une large sensibilité même en cas d'acquisitions multiples et indépendantes de virus variants à partir d'un réservoir animal."
Cette déclaration démontre que le gène E utilisé dans le test RT-PCR, tel que décrit dans l'article de Corman-Drosten, n'est pas spécifique au SRAS-CoV-2.
Les amorces du gène E détectent également un large spectre d'autres virus du SRAS.
Le génome du coronavirus est le plus grand de tous les virus à ARN qui infectent les humains et ils ont tous une structure moléculaire très similaire. Néanmoins, le SARS-CoV1 et le SARS-CoV-2 possèdent deux empreintes génétiques très spécifiques qui les distinguent des autres coronavirus. Premièrement, une séquence d'empreinte unique (KTFPPTEPKKDKKKK) est présente dans la protéine N du SARS-CoV et du SARS-CoV-2 [13,14,15]. Deuxièmement, le SARS-CoV1 et le SARS-CoV2 ne contiennent pas la protéine HE, alors que tous les autres coronavirus possèdent ce gène [13, 14]. Ainsi, afin de détecter spécifiquement un produit PCR de SARS-CoV1 et SARS-CoV-2, la région susmentionnée du gène N aurait dû être choisie comme cible d'amplification. Un test de diagnostic fiable devrait se concentrer sur cette région spécifique du gène N en tant que test de confirmation. La PCR pour ce gène N n'a pas été validée plus avant ni recommandée comme gène de test par l'article de Drosten-Corman, parce qu'elle n'était "pas aussi sensible" avec la sonde originale du CoV-SRAS [1].
En outre, l'absence du gène HE dans les virus SARS-CoV1 et SARS-CoV-2 fait de ce gène le témoin négatif idéal pour exclure les autres coronavirus. Le document de Corman-Drosten ne contient pas ce contrôle négatif, ni aucun autre contrôle négatif. Le test PCR de l'article de Corman-Drosten ne contient donc ni un contrôle positif unique ni un contrôle négatif permettant d'exclure la présence d'autres coronavirus. Il s'agit d'un autre défaut de conception majeur qui rend le test impropre au diagnostic.
Il devrait y avoir une procédure opérationnelle standard (POS) disponible, qui spécifie sans équivoque les paramètres ci-dessus, afin que tous les laboratoires soient en mesure de mettre en place les mêmes conditions de test. Il est essentiel de disposer d'une SOP universelle validée, car elle facilite la comparaison des données dans et entre les pays. Il est très important de spécifier tous les paramètres d'amorçage sans équivoque. Nous constatons que cela n'a pas été fait. De plus, la valeur Ct pour indiquer quand un échantillon doit être considéré comme positif ou négatif n'est pas spécifiée. Il n'est pas non plus précisé à quel moment un échantillon est considéré comme infecté par les virus du SRAS-CoV. Comme on l'a vu plus haut, le test ne peut pas faire la distinction entre le virus et les fragments de virus, de sorte que la valeur Ct indiquant la positivité est d'une importance cruciale. Cette valeur Ct aurait dû être spécifiée dans la procédure opérationnelle standard (PON) et mise en ligne afin que tous les laboratoires effectuant ce test disposent exactement des mêmes conditions limites. Le fait qu'une telle SOP n'existe pas témoigne d'une science déficiente. Les laboratoires sont donc libres de réaliser le test comme ils l'entendent, ce qui entraîne d'énormes variations. Les laboratoires de toute l'Europe se retrouvent avec une multitude de questions : quelles amorces commander ? quels nucléotides remplir aux endroits non définis ? quelle valeur Tm choisir ? Combien de cycles de PCR effectuer ? A quelle valeur de Ct l'échantillon est-il positif ? Et quand est-il négatif ? Et combien de gènes à tester ? Faut-il tester tous les gènes, ou seulement les gènes E et RpRd comme indiqué dans le tableau 2 de l'article de Corman-Drosten ? Le gène N doit-il également être testé ? Et quel est leur contrôle négatif ? Quel est leur contrôle positif ?
7. Conséquences des erreurs décrites aux points 1-5 : résultats faussement positifs.
"Dans quatre réactions individuelles, une faible réactivité initiale a été observée, mais elle s'est avérée négative lors d'un nouveau test avec la même méthode. Ces signaux n'étaient pas associés à un virus particulier, et pour chaque virus avec lequel une réactivité initiale positive s'est produite, il y avait d'autres échantillons qui contenaient le même virus à une concentration plus élevée mais qui n'ont pas donné de résultats positifs. Compte tenu des résultats de la qualification technique approfondie décrite ci-dessus, il a été conclu que cette réactivité initiale n'était pas due à l'instabilité chimique des sondes PCR en temps réel et très probablement à des problèmes de manipulation causés par l'introduction rapide de nouveaux tests de diagnostic et de contrôles pendant cette étude d'évaluation."
Une autre observation révélatrice dans l'extrait ci-dessus est que les auteurs expliquent les faux positifs par des "problèmes de gestion causés par l'introduction rapide de nouveaux tests de diagnostic". Imaginez les laboratoires qui doivent introduire le test sans disposer de toutes les informations nécessaires normalement décrites dans une PON.
8. L'article de Corman-Drosten n'a pas fait l'objet d'un examen par les pairs
Avant d'être publiés officiellement dans une revue savante, les articles scientifiques et médicaux sont traditionnellement certifiés par un "examen par les pairs". Dans ce processus, les rédacteurs de la revue prennent l'avis de divers experts ("arbitres") qui ont évalué l'article et peuvent identifier des faiblesses dans ses hypothèses, méthodes et conclusions. En règle générale, une revue ne publie un article que lorsque les rédacteurs sont convaincus que les auteurs ont répondu aux préoccupations des arbitres et que les données présentées soutiennent les conclusions tirées dans l'article." Ce processus est également décrit pour Eurosurveillance [16].
L'article de Corman-Drosten a été soumis à Eurosurveillance le 21 janvier 2020 et accepté pour publication le 22 janvier 2020. Le 23 janvier 2020, l'article a été mis en ligne. Le 13 janvier 2020, la version 1-0 du protocole a été publiée sur le site officiel de l'OMS [17], mise à jour le 17 janvier 2020 en tant que version 2-1 du document [18], avant même que l'article de Corman-Drosten ne soit publié le 23 janvier dans Eurosurveillance.
Normalement, l'examen par les pairs est un processus qui prend du temps, car au moins deux experts du domaine doivent lire de manière critique et commenter l'article soumis. À notre avis, cet article n'a pas fait l'objet d'un examen par les pairs. Vingt-quatre heures ne sont tout simplement pas suffisantes pour effectuer un examen approfondi par les pairs. Notre conclusion est étayée par le fait que nous avons relevé un très grand nombre de défauts de conception très graves, qui rendent le test PCR totalement inadapté en tant qu'outil de diagnostic pour identifier le virus du SRAS-CoV-2. Tout biologiste moléculaire familier de la conception de la RT-PCR aurait facilement observé les graves erreurs présentes dans l'article de Corman-Drosten avant le processus de révision proprement dit. Nous avons demandé à Eurosurveillance le 26 octobre 2020 de nous envoyer une copie du rapport d'examen par les pairs. À ce jour, nous n'avons pas reçu ce rapport et dans une lettre datée du 18 novembre 2020, l'ECDC, en tant qu'hôte d'Eurosurveillance, a refusé de nous donner accès à ce rapport sans fournir de raisons scientifiques substantielles pour justifier sa décision. Au contraire, ils écrivent que "la divulgation porterait atteinte à l'objectif des enquêtes scientifiques." [24].
Un dernier point est très préoccupant. Il s'avère que deux auteurs de l'article de Corman-Drosten, Christian Drosten et Chantal Reusken, sont également membres du comité de rédaction de ce journal [19]. Il y a donc un grave conflit d'intérêts qui renforce les soupçons selon lesquels l'article n'a pas été examiné par des pairs. Il semble que la publication rapide ait été possible simplement parce que les auteurs faisaient également partie du comité de rédaction d'Eurosurveillance. Cette pratique est considérée comme une atteinte à l'intégrité scientifique.
Le document Corman-Drosten contient les erreurs spécifiques suivantes :
1. Il n'existe aucune raison spécifique d'utiliser ces concentrations extrêmement élevées d'amorces dans ce protocole. Les concentrations décrites entraînent une augmentation des liaisons non spécifiques et des amplifications du produit PCR, ce qui rend le test inadapté en tant qu'outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus SARS-CoV-2.
2. Six positions bancales non spécifiées introduiront une énorme variabilité dans les mises en œuvre de ce test dans les laboratoires du monde réel ; la description non spécifique déroutante dans l'article de Corman-Drosten ne convient pas comme protocole opérationnel standard, ce qui rend le test inadapté comme outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus SARS-CoV-2.
3. Le test ne peut pas faire la distinction entre le virus entier et les fragments viraux. Par conséquent, le test ne peut pas être utilisé pour diagnostiquer les virus intacts (infectieux), ce qui le rend inadapté en tant qu'outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus du SRAS-CoV-2 et faire des déductions sur la présence d'une infection. 4.
4. Une différence de 10° C par rapport à la température d'hybridation Tm pour la paire d'amorces 1 (RdRp_SARSr_F et RdRp_SARSr_R) rend également le test inadapté en tant qu'outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus SARS-CoV-2.
5. Une erreur grave est l'omission d'une valeur Ct à laquelle un échantillon est considéré comme positif et négatif. Cette valeur Ct ne figure pas non plus dans les soumissions de suivi, ce qui rend le test inadapté en tant qu'outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus du SRAS-CoV-2.
6. Les produits de la PCR n'ont pas été validés au niveau moléculaire. Ce fait rend le protocole inutile en tant qu'outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus du SRAS-CoV-2.
7. Le test PCR ne contient ni un contrôle positif unique permettant d'évaluer sa spécificité pour le SARS-CoV-2 ni un contrôle négatif permettant d'exclure la présence d'autres coronavirus, ce qui rend le test inutilisable comme outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus SARS-CoV-2.
8. La conception du test dans l'article de Corman-Drosten est tellement vague et imparfaite qu'elle peut prendre des dizaines de directions différentes ; rien n'est normalisé et il n'y a pas de procédure opératoire normalisée. Cela remet fortement en question la validité scientifique du test et le rend impropre à servir d'outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus SRAS-CoV-2.
9. Il est fort probable que l'article de Corman-Drosten n'ait pas fait l'objet d'un examen par les pairs, ce qui rend le test inadapté en tant qu'outil de diagnostic spécifique pour identifier le virus du SRAS-CoV-2.
10. Nous trouvons de graves conflits d'intérêts pour au moins quatre auteurs, en plus du fait que deux des auteurs de l'article de Corman-Drosten (Christian Drosten et Chantal Reusken) sont membres du comité éditorial d'Eurosurveillance. Un conflit d'intérêts a été ajouté le 29 juillet 2020 (Olfert Landt est PDG de TIB-Molbiol ; Marco Kaiser est chercheur principal chez GenExpress et sert de conseiller scientifique pour TIB-Molbiol), qui n'avait pas été déclaré dans la version originale (et qui manque toujours dans la version PubMed) ; TIB-Molbiol est la société qui a été "la première" à produire des kits PCR (Light Mix) basés sur le protocole publié dans le manuscrit de Corman-Drosten, et selon leurs propres mots, ils ont distribué ces kits de test PCR avant même que la publication ne soit soumise [20] ; en outre, Victor Corman & Christian Drosten ont omis de mentionner leur deuxième affiliation : le laboratoire de tests commerciaux "Labor Berlin". Tous deux y sont responsables du diagnostic des virus [21] et la société opère dans le domaine des tests PCR en temps réel.
La décision de publier et de rendre largement disponibles les protocoles de test est entre les mains d'Eurosurveillance. La décision de reconnaître les erreurs apparentes dans l'article de Corman-Drosten a l'avantage de minimiser considérablement le coût humain et la souffrance à l'avenir.
N'est-il pas dans le meilleur intérêt d'Eurosurveillance de retirer ce document ? Notre conclusion est claire. Face à tous les énormes défauts de conception et erreurs du protocole PCR décrits ici, nous concluons : Il ne reste plus beaucoup de choix dans le cadre de l'intégrité et de la responsabilité scientifiques.
Nolan T, Huggett J, Sanchez E.Good practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR) First Edition 2013
1) Dr Pieter Borger (MSc, PhD), Génétique moléculaire, associé de recherche W+W, Lörrach, Allemagne
2) Rajesh Kumar Malhotra (Artiste Alias : Bobby Rajesh Malhotra), Ancien Artiste 3D / Visualisations scientifiques au CeMM - Centre de médecine moléculaire de l'Académie autrichienne des sciences (2019-2020), Université des arts appliqués - Département des arts numériques Vienne, Autriche
4) Dr. Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, Royaume-Uni
5) Kevin McKernan, BS Emory University, directeur scientifique, fondateur de Medical Genomics, a conçu le pipeline de séquençage au WIBR/MIT pour le projet du génome humain, a inventé et développé le séquenceur SOLiD, a obtenu des brevets liés à la PCR, à l'isolation de l'ADN et au séquençage, États-Unis.
6) Prof. Dr. Klaus Steger, Département d'urologie, d'urologie et d'andrologie pédiatriques, d'andrologie moléculaire, Centre de recherche biomédicale de l'Université Justus Liebig, Giessen, Allemagne.
8) Dr. Lidiya Angelova, MSc en biologie, PhD en microbiologie, ancienne chercheuse au National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), Maryland, USA
15) Dorothea Gilbert (MSc, PhD), docteur en chimie et toxicologie de l'environnement. DGI Consulting Services, Oslo, Norvège
16) Dr. Rainer J. Klement, PhD. Département de radio-oncologie, Hôpital Leopoldina de Schweinfurt, Allemagne
17) Dr. Ruth Schruefer, PhD, génétique humaine/immunologie, Munich, Allemagne,
18) Dra. Berber W. Pieksma, médecin généraliste, Pays-Bas
19) Dr. Jan Bonte (GJ), Neurologue consultant, Pays-Bas
20) Dr. Bruno H. Dalle Carbonare (biologiste moléculaire), spécialiste en PI, BDC Bâle, Suisse
21) Dr Kevin P. Corbett, MSc Nursing (Kings College London) PhD (London South Bank) Social Sciences (Science & Technology Studies) London, England, United Kingdom
22) Prof. Dr. Ulrike Kämmerer, spécialiste en Virologie / Immunologie / Biologie humaine / Biologie cellulaire, Hôpital universitaire de Würzburg, Allemagne
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