COMPOSITION POUR PCR CONTENANT UN OXYDE DE GRAPHENE NANO-SISÉ ENGRADRÉ PAR DU POLYETHYLENE GLYCOL Demande de brevet américain 20180155765
Article original sur Silvia Media
1. Domaine de l'invention
La présente invention concerne une composition pour PCR comprenant de l'oxyde de graphène nanométrique greffé au polyéthylène glycol (PEG-nGO), la composition pour PCR étant capable d'augmenter l'efficacité et la spécificité de la PCR et de raccourcir le temps de PCR, et une méthode de PCR l'utilisant.
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode d'amplification artificielle de l'ADN et une technologie indispensable à la biotechnologie moderne et à la biologie moléculaire. La PCR est largement utilisée dans les domaines du diagnostic, de la manipulation des gènes, des biocapteurs et dans de nombreux autres domaines. Cependant, la spécificité et l'efficacité de la PCR peuvent être réduites en raison d'un (ré)anneau involontaire d'ADN simple brin (par exemple, dimérisation de l'amorce, liaison incorrecte de l'amorce et ré-annexion des amplicons de PCR). La liaison non spécifique des amorces lors des étapes de la PCR peut entraîner la génération d'un grand nombre d'amplicons non spécifiques, ce qui peut être confirmé par une électrophorèse sur gel d'agarose. C'est-à-dire que le maculage d'une bande PCR, qui est observé dans un gel d'agarose électrophorisé, indique la présence d'un grand nombre d'ADN ayant des tailles similaires (c'est-à-dire des amplicons non spécifiques). Lorsqu'une matrice d'ADN est amplifiée de manière excessive dans une PCR et que les mêmes amorces sont utilisées dans la deuxième PCR ou une PCR ultérieure, des amplicons non spécifiques peuvent être générés. Pour résoudre ces problèmes, diverses techniques de PCR telles que la PCR nichée ont été développées. Dans la première étape de la PCR nichée, on utilise un ensemble d'amorces pour amplifier une large gamme incluant une séquence cible sur une matrice d'ADN, et dans la seconde étape, des séquences d'amorces pour amplifier uniquement la séquence cible sont généralement utilisées comme ensemble d'amorces internes (amorces nichées).
En outre, des études ont été menées pour augmenter l'efficacité et la spécificité de la PCR en utilisant divers nanomatériaux tels que les nanoparticules d'or, les nanotubes de carbone, la poudre de carbone, les nanoflocons de graphène, les points quantiques de tellurure de cadmium, les points quantiques de graphène, les dendrimères et le dioxyde de titane. Par exemple, les nanoflocons de graphène servent à améliorer l'efficacité de la PCR en augmentant la conductivité thermique d'un mélange PCR, et les nanoparticules d'or peuvent être adsorbées à l'ADN et aux protéines pour réduire l'amplification de produits d'ADN non spécifiques. Cependant, ces méthodes présentent un inconvénient : la spécificité et l'efficacité de la PCR peuvent ne pas être fondamentalement résolues en présence de chaque nanoparticule. La question de savoir si les nanoparticules d'or jouent un rôle dans l'augmentation de la spécificité de la PCR est également controversée.
L'oxyde de graphène (GO) est un matériau présentant une nanostructure en forme de nid d'abeille, dans laquelle les carbones sont disposés selon un réseau hexagonal, et qui est préparé par oxydation d'une couche unique de graphite, c'est-à-dire de graphène. La surface du GO peut avoir divers groupes fonctionnels tels que des groupes époxy, des groupes hydroxyle et des groupes carboxyle, qui permettent au GO d'être dissous dans un solvant hydrosoluble. En outre, le GO peut se lier aux acides nucléiques simple brin via une interaction d'empilement π et une liaison hydrogène, mais a une faible affinité avec les acides nucléiques double brin. Sur la base de ses fonctions, le GO a été largement appliqué dans divers domaines tels que la détection de l'ADN, les biocapteurs basés sur le transfert d'énergie par résonance de fluorescence et la surveillance en temps réel des acides nucléiques marqués par fluorescence.
Cependant, le GO n'est pas soluble dans une solution tampon contenant du Mg2+ et une forte concentration de sel, comme un tampon PCR, et il est adsorbé sur des protéines comme une ADN polymérase via une liaison non covalente. Il est bien connu que les cations divalents tels que le Mg2+ induisent une forte réticulation entre les feuilles de GO, permettant aux feuilles de GO d'être agrégées. Ainsi, lorsque d'autres sels sont ajoutés à un échantillon PCR pour le tamponner, les feuilles de GO peuvent être agrégées par des cations divalents tels que Mg2+. En outre, il a été signalé que le GO se lie aux protéines pour induire l'agrégation des protéines, ce qui peut déformer les structures des protéines et entraîner la perte de fonction des protéines. Le polyéthylène glycol (PEG) est connu comme un polymère biocompatible qui réduit l'adsorption des protéines. Récemment, afin de minimiser l'adsorption non spécifique des protéines et d'augmenter la solubilité du GO dans une solution à forte concentration de sel, du GO de taille nanométrique (nGO) a été préparé, et la surface du nGO a été recouverte de PEG pour préparer le PEG-nGO (document non breveté 1). Dans le document non breveté 1, il est divulgué que, lorsque le PEG-nGO interagit avec une protéine, une interface nano-bio peut être formée en raison de la PEGylation de la surface du GO, réduisant ainsi de manière significative l'adsorption du PEG-nGO sur la protéine. En conséquence, le PEG-nGO attire l'attention en tant que substance capable d'interagir avec les protéines sans altérer la structure et la fonction des protéines.
Par conséquent, les présents inventeurs ont essayé de confirmer l'effet du PEG-nGO sur l'efficacité et la spécificité de la PCR. Pendant l'étape de dénaturation de la PCR, l'oxyde de graphène nanométrique greffé au polyéthylène glycol (PEG-nGO) était capable d'être adsorbé sur des amorces monocaténaires et une matrice d'ADN. En conséquence, lorsque le PEG-nGO est ajouté à un échantillon PCR et que l'amplification PCR est effectuée, dans un processus PCR initial dans lequel une quantité excessive d'amorces est incluse, la dimérisation des amorces est inhibée, et dans un processus PCR tardif dans lequel les produits PCR amplifiés sont accumulés, le recuit non spécifique entre les produits PCR amplifiés et les autres brins d'ADN est inhibé. Ainsi, il a été confirmé que, lorsque la PCR est effectuée en utilisant une composition pour PCR comprenant le PEG-nGO de la présente invention, l'efficacité et la spécificité de la PCR peuvent être améliorées et le temps de PCR peut être raccourci par rapport aux techniques de PCR conventionnelles. En confirmant ces résultats, la présente invention a été complétée.
Ou peut-être voulez-vous en savoir plus sur les nano-biocapteurs à base de GO :
Traduction de la conclusion
"Dans la présente étude, notre objectif était d'examiner le stress oxydatif dans les tissus organiques après l'administration d'une dose unique (5 mg/kg) d'oxyde de nano-graphène biocompatible. Le stress oxydatif causé par des oxydants tels que le peroxyde lipidique, et l'activité des antioxydants, notamment la catalase, la superoxyde dismutase, le glutathion et la glutathion S-transférase, ont été contrôlés. L'augmentation de la concentration de MDA accompagnée d'une réduction des niveaux d'activité des enzymes antioxydantes indiquait directement que tous les organes étaient en situation de stress oxydatif après l'administration intrapéritonéale de PEG-nGO. Ces études ont réaffirmé la cytotoxicité de l'oxyde de graphite in vivo. D'autres évaluations et recherches sur la sécurité doivent être entreprises afin d'établir l'utilisation de ces nanoparticules polymères biocompatibles dans les tissus humains pour des applications cliniques."
D'autres études comparent le graphène et les nanotubes de carbone à l'amiante :
Traduction :
"Les auteurs ont déclaré que "sur la base des rares preuves disponibles, il ne peut être exclu que certaines formes de graphène soient aussi puissantes en termes de toxicité que les nanotubes de carbone". Cette déclaration fait planer le spectre de propriétés semblables à celles de l'amiante pour les nanotubes de carbone(5), mais selon un rapport récent publié par le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC), seuls certains types de nanotubes de carbone rigides et multiparois peuvent être classés comme potentiellement cancérigènes pour l'homme."
Plus d'informations sur l'étude citée ci-dessus : "En outre, il est tout aussi important que les propriétés du matériau soient rapportées dans leur intégralité dans les articles traitant de l'évaluation de l'(éco)toxicité des GBM. Les informations recueillies sur la sécurité des GBM peuvent-elles être appliquées à d'autres matériaux 2D ? Nous pensons que certains aspects peuvent être communs à tous les matériaux 2D, ou même à tous les nanomatériaux, tandis que certains matériaux 2D "post-carbone" présenteront probablement des problèmes spécifiques. Par exemple, la propension à se dissoudre dans un environnement biologique avec la libération d'espèces ioniques qui sont plus réactives sur le plan biologique/chimique que le matériau 2D parental est un problème qui n'a pas été décrit pour les GBM.(346) De plus, Guiney et al.(347) ont récemment fait remarquer qu'"avec une bibliothèque de matériaux 2D en constante expansion, la capacité à prédire les résultats toxicologiques est d'une importance critique" et ont suggéré que les approches de criblage à haut débit peuvent s'avérer utiles pour élucider les interactions cellulaires des matériaux 2D. Cependant, le problème n'est pas tant le faible débit des approches actuelles que la conception incohérente des tests de toxicité couramment utilisés et le manque fréquent de caractérisation des matériaux. En effet, une caractérisation minutieuse du matériau et du système d'essai est nécessaire, et une proposition a récemment été avancée pour des exigences minimales de déclaration dans les publications traitant des nano-interactions. Bien que ces exigences n'aient pas encore été adoptées, il est important de discuter de ces questions au sein de la communauté scientifique. En conclusion, le battage médiatique qui accompagne inévitablement les avancées technologiques devrait être tempéré par une évaluation solide, fondée sur des données scientifiques, de l'impact potentiel sur la santé humaine et l'environnement, afin de garantir un développement sûr et durable des nouveaux produits et applications."
Et nous découvrons que la cytoxicité est largement connue dans l'industrie, grâce à un brevet d'invention très intéressant que j'ai déniché et qui fournit d'excellentes informations de base, c'est beaucoup, mais il nous donne de grands détails sur l'étendue de l'utilisation de GO et son impact sur la santé :
Points quantiques de graphène biocompatibles pour des applications d'administration de médicaments et de bioimagerie - United States Patent 9642815
Résumé :
Dans ce travail, nous avons ciblé deux aspects des GQDs, la taille et les ROS pour réduire leur cytotoxicité. La petite taille peut endommager les organites cellulaires et la production de ROS (espèces réactives de l'oxygène) peut entraver la machinerie cellulaire de multiples façons. Nous avons montré que la cytotoxicité peut être considérablement réduite en intégrant les GQDs à l'intérieur de la matrice PEG plutôt qu'en créant une fine enveloppe autour de chaque GQD. Une fine enveloppe de PEG autour des GQD peut contrôler la production de ROS mais ne peut pas contourner la toxicité en raison de leur petite taille. Il était donc essentiel de résoudre ces deux problèmes. Nous avons utilisé une méthode électrochimique simple (12 h à température ambiante) pour synthétiser des GQDs et les intégrer dans une matrice PEG via une réaction hydrothermique simple en une étape (24 h à 160° C.) impliquant uniquement des GQDs, du PEG et de l'eau désionisée. Les P-GQDs formés après la réaction hydrothermique présentent des nanoparticules d'un diamètre de ˜80-100 nm contenant des GQDs piégés dans la matrice PEG. Le test MTT a montré une viabilité cellulaire significative de 60% à une concentration très élevée de 5,5 mg/mL de P-GQDs par rapport à 10-15% de viabilité pour C-GQD et H-GQD. La production de ROS par les P-GQDs était plus faible que celle des C-GQD et H-GQD dans les tests de ROS libres et intracellulaires, ce qui suggère l'implication des ROS dans la cytotoxicité. Dans ce travail, nous avons résolu le problème de la cytotoxicité due à la " petite taille " et à la " génération de ROS " sans compromettre les propriétés de fluorescence des GQDs. Les P-GQDs ont été utilisés pour la bioimagerie et l'administration de médicaments dans des cellules HeLa. En bref, nous pouvons obtenir des P-GQDs biocompatibles en très peu de temps avec une utilisation minimale de produits chimiques dangereux et une méthodologie simple.
CONTEXTE ET ART ANTÉRIEUR DE L'INVENTION
Un point quantique est une nanostructure semi-conductrice qui confine le mouvement des électrons de la bande de conduction, des trous de la bande de valence ou des excitons dans les trois directions de l'espace. Les points quantiques (QD) sont traditionnellement des chalcogénures (séléniures ou sulfures) de métaux comme le cadmium ou le zinc (CdSe ou ZnS), dont le diamètre varie de 2 à 10 nanomètres.
Les QDs ont des propriétés optiques et électroniques uniques telles que l'émission de lumière réglable en taille, des spectres d'émission étroits et symétriques, et des spectres d'absorption larges qui permettent l'excitation simultanée de plusieurs fluorescences. De plus, les QDs sont plus résistants au photoblanchiment que les colorants organiques et les protéines fluorescentes. Ces propriétés sont bien adaptées à l'imagerie dynamique au niveau de la molécule unique et aux diagnostics biomédicaux multiplexés à très haute sensibilité.
Cependant, pour l'imagerie in vivo et clinique, la toxicité potentielle des QDs reste une préoccupation majeure. La nature toxique des QDs contenant du cadmium n'est plus un facteur pour les diagnostics in vitro, puisque l'utilisation émergente des QDs fluorescents pour les diagnostics moléculaires et la pathologie est une application importante et cliniquement pertinente pour les QDs semi-conducteurs. (Kairdolf. B. et al., Annual Rev. of Analytical Chem. Vol. 6 : 143-162.)
Dans la pratique courante, l'utilisation de nanoparticules de carbone dans la synthèse de points quantiques, est apparue comme une nouvelle classe de nanomatériaux fluorescents de type point quantique. Les nanoparticules de carbone sont utilisées car leur taille peut être contrôlée entre 3 et 20 nm. Les atomes de carbone sont liés en formes hexagonales, où chaque atome de carbone est lié de manière covalente à trois autres atomes de carbone pour former des feuilles de graphène. Le graphène a la même structure d'atomes de carbone liés en formes hexagonales pour former des nanotubes de carbone, mais le graphène est plat plutôt que cylindrique.
Les points quantiques de graphène (GQD) sont utilisés comme fluorophores pour la bioimagerie, en raison de leurs propriétés physicochimiques, notamment leur photoluminescence accordable, leur excellente photostabilité et leur biocompatibilité. Les GQD, dont la taille est généralement inférieure à 50 nm, présentent d'excellentes propriétés fluorescentes. Grâce à la stabilité de leur luminescence, à leur durée de vie de l'ordre de la nanoseconde, à leur biocompatibilité, à leur faible toxicité et à leur grande solubilité dans l'eau, les GQD se révèlent être d'excellentes sondes pour les applications de bioimagerie et de biodétection à haut contraste.
Des références peuvent être faites aux documents de l'art antérieur pour les méthodes de synthèse de GQDs utilisant des procédés électrochimiques, des méthodes hydrothermales et le procédé Hummers modifié pour la synthèse d'oxyde de graphène et des essais de cytotoxicité pour déterminer l'absorption cellulaire des GQDs résultants formés par ces procédés.
La publication du brevet américain, US 2013/0175182 fournit un procédé de transformation de nanotubes de carbone à paroi simple, double ou multiple en nanorubans composés de quelques couches de graphène par un procédé électrochimique en deux étapes. Le procédé consiste à oxyder les nanotubes de carbone (NTC) dispersés pour obtenir de l'oxyde de NTC, puis à le réduire pour former des couches de graphène.
Dans une publication de recherche, Chem. Commun, 2011, 6858-6860, Zhu et al, décrivent une méthode de préparation des GQDs dans laquelle la méthode Hummers modifiée est utilisée pour la synthèse de l'oxyde de graphène et la méthode hydrothermique pour la synthèse des GQDs afin d'obtenir des GQDs d'une taille de particule de 5,3 nm. À des concentrations de 2,6 mg/ml, une viabilité cellulaire de 80 % est observée.
Par ailleurs, Jianhua Shen et al. dans New J. Chem., 2012, 36, 97-101 ont rapporté une réaction hydrothermique en un pot pour la préparation de points quantiques de graphène passivés en surface par du polyéthylène glycol (GQDs-PEG) et leur conversion photoélectrique sous une lumière proche de l'infrarouge, en utilisant de petites feuilles d'oxyde de graphène (GO) et du polyéthylène glycol (PEG) comme matériaux de départ.
Juan Peng et al. (Nano Lett., 2012, 12 (2), pp 844-49) décrivent le traitement acide et l'exfoliation chimique de fibres de carbone, pour obtenir des GQDs dans la gamme de taille de 1-4 nm. La publication prévoit que les GQDs dérivés n'ont aucune toxicité à des concentrations de 0,05 mg/ml. Cependant, la cytotoxicité des GQDs à des concentrations plus élevées n'est pas expliquée.
Chang Ming Li et al, (J. Mater. Chem., 2012, 8764-66) fournissent une méthode pour développer des points quantiques de graphène (GQDs) à partir de noir de carbone XC-72 par oxydation chimique, cependant les tests de toxicité confirment une viabilité cellulaire maximale à des concentrations de 0,1 mg/ml.
La toxicité des GQD est attribuée à leur taille, puisque les GQD de petite taille interagissent avec diverses protéines et organelles à l'intérieur de la cellule et perturbent les processus cellulaires. Une autre raison de cette toxicité est leur capacité à générer davantage d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Les polymères, en particulier l'enrobage PEG, ont été utilisés dans la littérature pour diminuer la toxicité des GQDs. Cependant, même après l'enrobage de polymère, la viabilité cellulaire à des concentrations plus élevées (>1 mg/ml) est faible. Cela s'explique probablement par le fait que, même si la production de ROS est réduite par l'enrobage de l'enveloppe polymère, la taille des GQDs après enrobage reste petite (inférieure à 50 nm) et se situe toujours dans la gamme de taille qui peut interagir avec les protéines et les organelles intracellulaires.
Dans les publications de recherche suivantes, on peut trouver des références à la PEGylation de nanoparticules de carbone et à la viabilité cellulaire déterminée à des concentrations de 1 mg/ml ou moins.
Bhunia et al. (Scientific Reports, 2013, 3:1473) décrivent des nanoparticules de carbone (FCN) qui sont enrobées de polymère avec du PEG et la toxicité cellulaire dépendante de la dose de ces nanoparticules fluorescentes. À une concentration de 1 mg/ml de la composition FCN-PEG, on observe une viabilité cellulaire de 55 à 60 %.
Zhuang Liu et al. (J. Am. Chem. Soc., 2008, 130 (33), pp 10876-10877) décrivent un nano-oxyde de graphène pégylé (NGO-PEG) d'une taille de 5-50 nm pour l'administration de médicaments anticancéreux insolubles dans l'eau, produit par la méthode Hummers.
Omid Akhavan et al. (J. Material. Chem., 2012, Vol. 22, 20626-33) décrivent des concentrations non toxiques de nanorubans de graphène pégylé pour l'imagerie sélective des cellules cancéreuses et la thérapie photothermique. A des concentrations de 1 mg/ml de la composition. 28% de viabilité cellulaire a été obtenue.
En outre, Lay C L et al. (Nanotechnology. 2010 Feb. 10 ; 21(6):065101) rapporte l'administration de paclitaxel par chargement physique sur des nanotubes de carbone greffés de poly (éthylène glycol) (PEG) pour une thérapie puissante contre le cancer.
Les tests de toxicité des GQDs synthétisés par les méthodes des arts antérieurs ci-dessus rapportent une viabilité cellulaire minimale à des concentrations de GQDs de 1 mg/ml, et moins que cela, ce qui pose des limites dans les applications d'imagerie cellulaire. Cependant, pour réaliser des applications biomédicales des GQDs, une faible toxicité des GQDs à des concentrations plus élevées est souhaitée pour l'imagerie cellulaire.
En vue de fournir des points quantiques de graphène (GQDs) avec des niveaux de cytotoxicité réduits à des concentrations plus élevées, c'est-à-dire supérieures à 1 mg/ml, les inventeurs actuels ont fourni une composition biocompatible d'un ou plusieurs points quantiques de graphène (GQDs) dans une matrice polymère nanométrique de polyéthylène glycol qui est plus grande que les GQDs de petite taille observés dans l'art antérieur. La matrice PEG contribue à réduire les radicaux réactifs de l'oxygène (ROS) générés par la surface des GQD tout en maintenant les petits GQD à l'intérieur de la matrice, ce qui réduit également leurs interactions indésirables avec les protéines et les organelles cellulaires.
En attendant, ces cinglés veulent l'utiliser pour traiter le cancer des os chez les enfants !
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